CAR-T细胞制造进入加速时代

 

因多种细胞免疫治疗在临床上的迅速发展,细胞治疗正在进入激动人心的时期。宾夕法尼亚大学的研究首次报道嵌合抗原受体(CAR)T细胞治疗慢性淋巴细胞性白血病(CLL)得到完全缓解,这是细胞治疗领域中巨大的进步。2012年诺华进一步安排了商业许可。从那时起,CAR已经成为治疗性免疫细胞最常见的基因修饰。过去5年来,全球开展超过200种CAR细胞临床试验。诺华和风筝制药两大企业在2016年12月美国血液学会(ASH)会议上报道了儿科急性淋巴细胞白血病(ALL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)多中心国际临床试验的可喜的治疗结果。基于这些进展,FDA将在今年某个时候将对商业性CAR细胞治疗药物进行监管审批。

CAR细胞疗法快速发展的同时,也面临多个挑战性的问题。除了重要的临床问题(即复发率,细胞因子释放综合征和神经毒性)之外,还有许多诸如制备细胞来源,一致性产品的生产以及将中心制备的细胞产品递送到远程临床点等需要关注的问题。这篇文章将关注TRANSFUSION读者较为关注的细胞采集及细胞制备的相关问题。

目前,几乎所有的CAR细胞试验都使用采集的单核细胞作为制造的起始原料。用于制造T细胞的原材料单核细胞(MNC)单采技术的目的是减少不需要的其他细胞(例如红细胞,血小板和粒细胞)。因为几乎所有的CAR细胞临床试验目前都是用自体细胞,所以单核细胞采集质量是T细胞产品制造中的重要影响因素。不幸的是,单核细胞(MNC)单采技术不能过滤循环恶性细胞。CAR-T的制备很多时候因为未能获得足够的细胞来源而达不到好的治疗效果。例如,在CLL中,收集的MNC 90%至95%由白血病母细胞组成,成为制造CAR-T细胞产品带来挑战。已报道的CAR-T细胞制造失败率(主要与无法满足所需治疗细胞剂量有关)在CLL中低至1%至5% 3〜7%,淋巴瘤14%。

充分认识单核细胞单采对CAR细胞产品制造影响是非常重要。每位患者都有自己的的疾病史,包括分期分型,持续时间,治疗史,合并症及其免疫状态等。其它影响因素还有采集的设备,操作员和操作程序等。采集程序(设备和操作程序)的标准化可以减少这种变量,但不能完全去除这些可变因素。

在本期“TRANSFUSION”杂志上,NIH(Allen et,al.)的输血医学系报道了研究了单核细胞(MNC)单采技术影响制造足量的CAR-T细胞的可行性。该研究分析了71例患者的自体血液成像术采集,入选了三项不同的CAR-T细胞治疗临床试验,包括具有血液恶性肿瘤和实体瘤的临床试验。作者指出,即使单采血液收集超过了2*109 CD3阳性细胞的目标,5%的CAR-T细胞产品不符合目标治疗剂量(0.3 * 106-3.0*106/kg)。如果收集少于2*109个CD31细胞,则31%的CAR-T产品不符合治疗目标。低T细胞数可能不利于制造,因为T细胞的成功扩增需要特定的接种浓度。在细胞培养之前的多个初始处理步骤期间可能的T细胞损失也可能解释达不到期望目标的原因。

在Allen及其同事的研究中报告的另一个重要发现是循环T细胞的浓度可以预测通过单采采集收集的T细胞产量。在临床造血干细胞移植领域已经成功应用了类似的方法,用于预测动员后血液分离术中的CD3+细胞产量。为了收集目标和制造的一致性和可预测性,研究者可能需要设置T细胞阈值(通过流式细胞术测量为CD3+细胞数,或作为替代标志物,作为绝对淋巴细胞计数[ALC])。目前,一些中心正在开始纳入ALC阈值,作为纳入CAR-T细胞试验入选标准的一部分。例如,西雅图儿童医院需要至少100个细胞/mL的ALC以纳入NCT02028455试验。然而,重要的是要明白,设置CD3+细胞收集目标可能因中心而异,因为CAR-T产品制造有多种方法和不同的潜在目标治疗剂量。

Allen团队的研究局限性是单核细胞的收集利用的是COBE血细胞分离机,今年年底就很难继续得到继续支持的方案。因此,需要验证已公布的更有效的其他设备与方式。然而,终归Allen团队最先探索了在细胞免疫治疗中心如何从最初收集的细胞治疗去评估预测对后期T细胞制备质量的影响。更重要的是,这些研究者给出了实际的建议:1)利用第一时间的CD3比率作为预测指标;2)并设定后期可建议继续制备的CD3阳性细胞数范围;3)以及提供后续CAR-T制备所用的所需血液量。

除了T细胞的质量,另外一个需要关注的是细胞的组成。参杂较多的其他细胞会影响整个CAR-T制备过程:1)增加T细胞的纯化及其它制备过程难度;2)增加转染病毒的困难;3)抑制T细胞的生长。比如,髓源细胞的参杂影响T细胞的扩增以及单核细胞的减少能有助于获得足够的制备CAR-T的细胞量。因此,研发合适的制备方法,控制合适的初选细胞的比率均有利用提高CAR-T细胞制备的最终成功。

极少数研究关注细胞组成与后期制备CAR-T成功的关系。费城儿童医院的研究人员表示存在“早期谱系”T细胞(如记忆T细胞和幼稚T细胞)直接与体外T细胞扩增的成功相关。患者血液中或者在采集的单采细胞中“早期谱系”T细胞较少很难实现T细胞预期的扩增。从24%的患者(20/83)收集的细胞没有达到这个“测试扩张”阈值,这些患者被排除在CD19-CAR-T细胞小儿B-ALL试验。宾夕法尼亚大学的另一组最近研究提示在CD8+ T细胞中CD27+CD45RO-比率与CD19-CAR T细胞治疗的CLL患者持久反应有着显著的相关性。有趣的是,国家癌症研究所和风筝制药的研究人员没有发现ALC,分离产物中的T细胞亚群组成,NHL患者临床反应以及CAR-T细胞最终生产没有明显相关性。

这些发现突显了最开始细胞来源的分离采集与CAR-T细胞产品制造成功之间潜在的影响。我们应该承意识到细胞来源的变异因素以及质量的可靠性是CAR-T细胞生产外部因素,但也足以可以导致最终的制造失败。因此提供了关于优化并联采集和减轻相关CAR-T细胞治疗制造失败的一些建议。

影响优先采集和减轻CAR-T细胞制造失败的因素与“不良采集”有关:

A采集标准:

1.设置绝对淋巴细胞或外周血中的CD3+细胞的可采集的最低范围

2.评估T细胞的采集目标

3.计算CD3+细胞获得率

4.评估用于CAR-T细胞产品制造CD31+细胞最低要求的数量

B单采程序规范化

1.从中心到中心规范采血程序,具体到条件和收集目标

2.专门为CAR-T细胞处理系列培训单采血液操作员

C 细胞制备规范化

1.注意原材料对CAR-T细胞制造的印象,设定准入条件

2.建立专门的初始处理步骤优化血液分离后的细胞组成

在CAR-T细胞领域工作的研究人员应通过会议摘要和出版物收集并分享关于取样,收集和临床结果相关性的数据。开发无人驾驶汽车的技术正在成为现实。然而,对于CAR-T制备技术,仍然需要谨慎操作,前方有一个漫长而又颠簸的道路。

参考文献:

Bersenev A.CAR-T cell manufacturing: time to put it in gear.Transfusion. 2017 May;57(5):1104-1106.